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牛海綿狀腦病:同一健康與食品安全的臨界點

牛海綿狀腦病:同一健康與食品安全的臨界點

James Hope

摘要 牛海綿狀腦病(Bovine spongiform encephalopathy, BSE)是一種牛的蛋白質錯誤折疊導致的疾病,屬于傳染性海綿狀腦病(Transmissible spongiform encephalopathies, TSE)或是朊病毒病的一種。牛海綿狀腦病還包括山羊和綿羊的癢病,鹿科動物的慢性消耗性疾病(Chronic wasting disease , CWD)和人類的克—雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease, CJD)。第一例BSE于1986年在英國發現,是一種進行性神經系統疾病,動物感染后主要表現行為反常、焦慮、共濟失調、對觸摸和噪音過分敏感以及體重減輕。對病牛進行解剖發現其腦干組織呈海綿狀水腫,病變與羊癢病的相似,相關部門對其進行生化分析和傳播機制研究,最終確認這是一種牛的新型朊病毒病。早期病例流行病學分析表明,兩者的感染源可能與飼料有關,于是英國各地采取了一系列措施嚴格限制使用哺乳動物源性蛋白對反芻動物進行飼養,并禁止在飼料或是其他的食品生產中使用牛的(內臟)雜碎。本章將從以下幾個方面進行概述:英國乃至整個歐洲BSE發病率的起伏變化、被界定為一種人畜共患病的變異型CJD的出現、BSE作為一種朊病毒病的含義、診斷和在世界范圍內控制BSE所面臨的挑戰。 

1朊病毒:BSE的致病因子

朊病毒(Prion)是由染色體DNA基因編碼的蛋白質,在細胞內表達時憑借其多肽鏈的可變折疊功能在細胞內或是在細胞與生物體之間傳遞信息。正常細胞蛋白質轉化為朊病毒形式通常涉及構象變化,這種構象變化可以影響蛋白質的自聯程度以及與其他分子相互作用的能力(Wickner et al. 2009)。在酵母和真菌中,由特殊蛋白質組成的朊病毒是一種非染色體遺傳形式存活特性的分子基礎,但在哺乳動物中是第一次既作為慢性神經退行性疾病,又作為傳染性海綿狀腦病(TSE)的一種病原體來研究。TSE的特征是哺乳動物的朊蛋白(prion protein, PrP)以朊病毒的形式聚積在動物和人的中樞神經系統和外周組織中(Prusiner 1997)。癢病即綿羊和山羊的TSE,克—雅氏病(CJD)是人類最常見的TSE,而新的變異型克—雅氏病(vCJD)則被認為由牛的TSE傳播引起的,即將瘋牛病(BSE)傳染給人。 

2瘋牛病簡史

瘋牛病(BSE)在過去25年中嚴重影響了英國的畜牧業,并限制了世界范圍內牛制品和動物飼料的貿易。第一例BSE發生于1985年4月,但直到20個月以后的1986年12月,Weybridge中央獸醫研究所才采用病原學方法確診牛群中的這類疾病(Wells et al. 1987)。期間有超過10萬頭牛感染了這種潛伏期長并且不能用血清學、聚合酶鏈反應或是其他宰前檢驗方法所檢測到的疾病。自此臨床病例開始流行,并于1993年在不列顛群島達到高峰,全年累計檢出超過37,000例(www.defra.gov.uk/vla/science/sci_tse_stats;圖1)。調查顯示,奶牛似乎比肉牛的患病風險更高,但不管是何種性別的牛,發病牛齡大多數為4~4.5歲(1.8~18歲之間)。

圖1 BSE流行曲線和英國飼料禁令效果

在英國,流行初期階段BSE通常發生在3~5歲的牛群,但隨著流行態勢減弱和暴露水平下降,出現此疾病癥狀的牛群平均年齡已經逐漸超過了13歲(EFSA 2009)。每個國家發病高峰年的不同反映出BSE從英國蔓延至整個歐洲交錯流行的特性。由于病牛在其病情進展過程中不會表現明顯的臨床癥狀(Wilesmith et al. 1988),并且無法檢測BSE的無癥狀攜帶者,這樣限制了關于避免使用受感染動物的組織用于制作飼料以及藥物產品措施的改進。 

3飼料禁令和加強禁令后的出生病例

對受BSE影響牛群采用流行病學分析發現,一種蛋白飼料添加劑是最可能的感染源(Wilesmith et al. 1988)。重復利用受感染牛群的排泄物也許是這種疾病持續存在的原因。英國在1989—1990年間出臺了關于反芻動物蛋白飼料的法規,旨在消除1988年以后出生牛群的感染,1996年該法開始變得更加嚴格,并在2001年在整個歐洲加強了這些禁令。最初英國禁令是為了防止反芻動物的同類相食,停止供應反芻動物的肉骨粉(meat and bone meal, MBM),從而防止朊病毒在牛群中的反復傳播和擴散。這種措施起到一定的作用但卻有著顯著的地域性差別,英國的南部和西部較北部和東部更有成效(見圖1)。由于北部和東部地區的豬所占比重高于牛群和羊群,因此人們開始懷疑是否應該在反芻動物的飼料成分中摻雜豬和家禽的飼料(在豬和家禽的飼料里面是可以添加反芻動物的肉骨粉的)。1994年11月,相關法令禁止向反芻動物喂食任何哺乳動物蛋白飼料(僅少數例外,如血液和牛奶中的蛋白質)。而1996年出現BSE和vCJD聯系的相關報道以后,當局不再允許向任何養殖的家畜(包括魚和馬)喂食哺乳動物蛋白飼料。隨后,整個歐洲對飼料實施了更加嚴格的控制以限制歐盟貿易區內BSE的傳播,并于2001年徹底禁止對用于食品生產的動物喂食任何加工過的動物蛋白(PAP)。但并不是世界上每一個有BSE風險的國家都實施了類似的嚴格禁令,而目前歐盟期望緩解立法所面臨的窘境,其中部分原因就是因為擔心感染性貨物入境,因而再次引入BSE。用豬和家禽的動物蛋白來飼養魚也仍在謹慎考慮中,雖然這些途徑對于BSE的再發影響可能很小(EFSA 2011),但是成員國之間對于用家禽的動物蛋白來飼養豬以及用豬的動物蛋白來飼養家禽這些問題也仍存在爭議。同類相食(即用某種加工動物蛋白來飼養同種動物)已被廣泛抵制,歐洲似乎也并未打算用反芻家畜動物加工蛋白來喂食任何一種動物。

在BSE歷史高峰時期的1993年,英國每周報道臨床病例超過1000例,最后一例臨床病例于2009年由被動監測系統發現(見圖1)。英國(及歐盟的其他一些國家)于2001年對病死牲畜和屠宰場的健康動物挑選出來的不同隊列(出生于1996年的喂飼禁令之后)開展了疾病主動監測。2011年檢測了約50萬只動物,其中僅有7只檢出BSE(均為死亡牲畜)。截至2012年6月英國僅檢出一例感染BSE的動物。雖然飼料禁令對流行曲線產生了顯著影響,但2000年歐洲加強禁令之后在牛群中仍能檢出BSE病例,食用被污染的蛋白飼料依然是造成大多數“禁令頒布后的出生病例(born after the real ban, BARB)”出現的疑似原因。盡管英國最近發生的兩例BARB,包括2012年的這一例,均有L型不典型BSE的分子特性(見下文Stack等人的報道),但這些出生于禁令頒布之后的病例它們的生物與生化特征卻與較前流行早期的病例相似。

與BSE流行的同時,傳染性海綿狀腦病的自然病例報道也首次見于牛的近緣種屬——大彎角羚、羚羊、白斑羚、非洲大羚羊、阿拉伯大羚羊和彎角劍羚(Cunningham et al. 2004)以及貓科類動物,如美洲獅、獵豹或家貓中。除了一些大彎角羚的病例,其他動物由于缺少詳細的喂養記錄,我們很難證明動物發病與污染的飼料存在關聯(Cunningham et al. 2004)。  

4對BSE朊病毒最低有效劑量和特定危險物質的控制

利用感染BSE的病牛腦組織勻漿進行口服實驗證實攝入1mg腦組織(大約10~100只小鼠的半數感染劑量)即可在8~10年的潛伏期后導致發病(Arnold et al. 2007, 2009; Wells et al. 2007)。英國(Wells et al. 2007)和德國(Hoffmann et al. 2007)學者曾在牛身上使用更大劑量的勻漿(至100g)來研究BSE的口服發病機制。他們用朊蛋白的免疫組化技術證實了這些研究,并對朊病毒在下消化道(遠端回腸和空腸)早期的分布進行了生物測定。結果顯示,朊病毒通過自主神經系統從腹腔腸系膜神經節上行至中樞神經系統,經過腹腔—腸系膜上神經節、內臟神經、腰部/尾椎胸椎脊髓或是經由迷走神經擴散。這些感染組織分布實驗的結論已被用作修訂不同年齡段牛群中禁止供給人類食用的具備特定風險的原料清單,并且為人和動物的暴露危險評估提供了依據,這些評估機制也明確了多年來英國和歐洲關于BSE控制管理的政策,例如最近歐洲食品安全局發表的關于食用牛腸的BSE風險的意見等。 

5  BSE的非典型形式

在歐洲針對異常朊蛋白于牛群中開展的BSE定期監測,可將牛的TSE進一步分為兩個不同的類別:分別稱之為H型和L型(或簡稱為BASE)BSE(Casalone et al. 2004; Biacabe et al. 2007; Jacobs et al. 2007; Polak et al. 2008)。在歐洲以外的地區(日本和美國)也檢測出類似病例(Hagiwara et al. 2007; Clawson et al. 2008)。盡管沒有法定要求在病例報告時必須區分典型和非典型的BSE,但據文獻報道顯示,目前世界范圍內大約有60例非典型BSE病例(約檢測5千萬健康動物以及死亡牲畜的結果)報告。

法國最近發表的一篇文章,回顧性研究了在2001~2007年期間通過歐盟強制性監測計劃所發現的所有朊病毒陽性的牛(Biacabe et al. 2008)。結果顯示,無論是“感染危險組”或是“健康狀態屠宰組”,通過速測法檢測到的H型和L型BSE動物病例均在8歲以上。該項研究所檢測的8歲以上動物的H型和L型傳染性海綿腦病的報告頻率分別為1.9/100萬和1.7/100萬。而歐盟所有的非典型病例均出生于2001年1月,即禁令開始生效或擴展施行之前。因此,與經典BSE一樣,這些動物不能排除因食用低滴度傳染性BSE污染的飼料而發病。然而法國H型和L型病例的出生年份分布規律卻與經典BSE明顯不同,這可能是因為兩種非典型BSE都是自發產生的散發病例。事實上,美國一例H型BSE病例與一種野生型的朊蛋白氨基酸序列上的一個可遺傳的、牛的E211 K突變有關(密碼子211中一個賴氨酸替換了一個谷氨酸),并且可以通過顱內接種傳播給攜帶同種突變等位基因的牛犢,接種后存活時間為301天。然而其他非典型病例的朊蛋白基因開放閱讀框的DNA測序卻并未顯示出這種或其他任何編碼區域的突變情況。

H型和L型(或BASE)BSE經過腦內激發,能傳播給可表達牛和綿羊朊蛋白的近交小鼠和Tg小鼠。L型的BSE也可傳播給表達人類朊蛋白等位基因的轉基因小鼠(Buschmann et al. 2006; Beringue et al. 2008; Kong et al. 2008)。近交小鼠和Tg VRQ小鼠的傳播和連續傳代說明了經過種間傳代,BASE可以產生經典BSE(Beringueet al. 2007; Capobianco et al. 2007)。然而,我們需要注意沒有在其他轉基因小鼠身上發現L型BSE到經典BSE的基因表型聚合包括表達綿羊朊蛋白ARQ等位基因的小鼠(Buschmann et al. 2006; Beringue et al. 2007)。具有經典BSE特性的朊病毒同樣出現在H型BSE的野生型小鼠的連續傳代中(Baronet al. 2011)。盡管這些現象仍需一套獨立的實驗來驗證,但是引發了經典BSE可能重新從非典型BSE病例中出現的討論。在傳代細胞培養中一個朊蛋白株突變為另一個朊蛋白株的概率為1/10萬(Oelschlegel et al. 2012; Weissmann 2012)。但無論是實驗還是動物的自然傳遞規律,一種朊蛋白突變為另一種朊蛋白(如從一個非人畜共患病的癢病變為人獸共患的BSE的顯性)的概率還不能確定。

目前經典傳染性BSE的快速篩查試驗的靈敏度和特異度是已知的,但是H型和L型的靈敏度和特異度卻未知。這些試驗以腦干為靶組織,因為牛的中樞神經系統是最早檢出病理性改變和朊蛋白的位置(Hope et al. 1988; Wells et al. 1998)。不同于經典BSE,我們對非典型BSE的發病機理了解甚少,而且腦干或許不能作為檢測H型和L型BSE的最佳靶位(Casalone et al. 2004),因此H型和L型BSE達1~2/100萬的患病率可能僅是一個低估值。H型和L型BSE已經傳播到牛群(Lombardi et al. 2008; Fukuda et al. 2009),且不同于經典型BSE,每一型的分子與病理特征都被保留了下來(Balkema-Buschmann et al. 2011; Okada et al. 2011a, b; Konold et al. 2012)。目前已有一些關于感染了非典型BSE后牛的外周組織傳染力分布的數據(Iwamaru et al. 2010; Okada et al. 2011a, b; Suardi et al. 2012),雖然較小型反芻動物的朊蛋白分布受到限制,但是感染L型(BASE)牛的各種骨骼肌具有感染性(用Tgbov小鼠由生物方法測得)并且在肌肉纖維中發現了免疫蛋白沉淀。  

6小型反芻動物BSE

Foster和同事的研究結果顯示牛BSE可以通過飼養或是腦內接種傳染給ARQ/ARQ綿羊和山羊(Foster et al. 1993)。隨后也有幾個研究報道BSE朊病毒在ARQ/ARQ綿羊中有著廣泛的傳播,發病機制與經典型癢病的自然病例相似(van Keulen et al. 2000)。雖然有人擔心小型反芻動物BSE在混合感染是可能被認作“癢病”,但可通過其生物和生化特性將其在盲法試驗中區分出來。歷史上,由于對小型反芻動物喂食與BSE來源有關的同種蛋白質補充劑,歐盟擔心它們可能會被綿羊和山羊感染而產生第二撥vCJD,從而加強了對綿羊和山羊的TSE的監測和對“沒有BSE”和“不排除BSE”的實驗室診斷。對小型反芻動物的BSE的確診則需要應用一種生物方法,這種生物方法應用了與區別變異型克-雅氏病和BSE特征時所使用的同樣的近交系小鼠(Bruce et al. 1997)。在嚴格的標準下只確診了兩例小型反芻動物的BSE(均為山羊)(Eloit et al. 2005; Jeffrey et al. 2006),并且目前預測歐洲小型反芻動物的BSE發病率可能很低。 

7變異型克-雅氏病

1996年4月,Will和同事報道了一種新型變異型CJD(Vcjd)(Will et al. 1996),它的首發癥狀、臨床表現、于英國聚集性發生的特點、分子結構(Collinge et al. 1996)和傳播途徑(Lasmezas et al. 1996; Bruce et al. 1997)均與BSE相似,立即引起了瘋牛病是其源頭的猜測(見圖2)。牛肉與牛副產品為控制疾病的傳播而被嚴格管制。盡管如此,仍有約3百萬的病牛運往人類食物供應鏈(Ghani et al. 2000)。目前我們仍可以感受到它的影響及英國為了防止人與人之間二代傳播所付出的代價(Garske和Ghani 2010)。

截止2012年6月,英國已經報告原發性病例176例,與輸血有關的二代病例3例。另外,法國報告26例、西班牙5例、歐洲其他地區16例;美國、加拿大、沙特阿拉伯、中國臺灣省和日本均有病例報告(www.cjd.ed.ac.uk/vcjdworld)。人類朊蛋白基因組多態性和基因突變可影響人類TSE的存活率和臨床病理表型,vCJD已經明確了和密碼子129(甲硫氨酸或是纈氨酸)二態性有關。在正常的白種人中這種二態性的比例為39%MM,50%MV和11%VV。在散發的vCJD病例中,這一比例為65%MM、17%MV和18%VV。所有確診的vCJD臨床病例都是MM純合子,雖然一例M/V雜合子的受血者出現亞臨床表現,但在其脾臟中檢出的是克雅氏朊病毒(Peden et al. 2010)。

圖2英國的BSE和vCJD:時間聯系。左邊粗條:BSE;右邊細條:vCJD病例

英國人口中vCJD流行的實際程度只能通過一些臨床的低發病率來估計,當地已經開展多次大規模調查,采用IHC或ELISA的方法尋找淋巴組織中(扁桃體或闌尾)存在異常朊蛋白(PrPCJD)的生化證據,這可為估計人群患病率提供依據。朊蛋白在動物間的傳播和復制機制的研究表明淋巴網狀組織在這些疾病的病理機制中起到主要作用,同時在vCJD患者的扁桃體和脾中也檢出異常朊蛋白。在1995—1999年間醫院存有檔案的外科摘除扁桃體和闌尾的早期研究中,用免疫組化技術檢測12,674份標本的PrPCJD時發現有三例的闌尾樣本中含異常朊蛋白。所有PrPCJD陽性個體都在20~30歲的隊列中,該年齡組的患病率約為380/100萬(95%置信區間:80~1120/100萬)(Hilton et al. 2004)。1961—1985年的出生隊列是一個高危隊列,包含了英國80%的vCJD病例。

每種分析方法的靈敏度和特異度均不同,95,672例(其中約有18,000例是來自1961—1985年的高危出生隊列)來自英國匿名扁桃體檔案的扁桃體標本,研究人員采用ELISA 法檢測其PrPCJD,并沒有檢出陽性樣本(Clewley et al. 2009);隨后的研究繼而使用免疫組化技術,在1961—1985年出生隊列的9672例扁桃體樣本中卻檢出一例陽性樣本(de Marco et al. 2010)。在最新的闌尾篩查研究中,32,441個合適樣本中有12~18個存在著異常朊蛋白積累,并且這些免疫組化陽性標本出現于所有密碼子-129基因型:MM、VV和MV。總患病率約為493/100萬(95%置信區間:82~801/100萬),與之前的結果一致。但令人驚訝的是只有13%的vCJD患者出生于1941—1960年之間,患病率最高為733/100萬(95%置信區間:269~1596/100萬),出現在年齡更大的出生隊列中(HPA2012)。

8同一健康

歐洲對于飼料和特定危險原料的嚴格控制措施對于BSE的流行起到了有效的遏制(并且限制了人于朊蛋白的暴露),但朊病毒作為一種表觀遺傳且結構重排的蛋白質不太可能被消滅,如果回歸到過去不加限制地對動物喂飼加工過的動物蛋白,將會引起傳染性BSE在食用性動物中再現。BSE和vCJD的出現,及其對于我們食品安全的觀念和實踐所產生的影響都強調了尋求一種統一的、全球化的方法解決朊病毒困境的必要性,從而維持農業可持續發展和滿足世界人口食物供應。由此可見,同一健康理念歷久彌新。

文章來源:人民衛生出版社《同一健康與食品安全》(主譯  陸家海  郝元濤)本文經主譯同意發布,未經主譯允許不得轉載

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